გაცივდით! კომპეტენტური უჯრედების შექმნის პროცესი რთულია უჯრედების სიცივის საჭიროების გამო. ეს გადამწყვეტია, რადგან უჯრედები არის ასე მგრძნობიარე და მყიფე, სანამ ისინი ხდებიან კომპეტენტური ტემპერატურის დაბალი შენარჩუნება ხელს უწყობს უჯრედების სიკვდილის თავიდან აცილებას დამუშავების დროს.
რატომ ინახება რეაქციები ყინულზე ტრანსფორმაციის ექსპერიმენტის დროს?
პლაზმიდური უჯრედის ნარევი შემდეგ ხანმოკლე თბება 45-50°C-მდე, რაც საშუალებას აძლევს დნმ-ს შევიდეს უჯრედში დაშლილი მემბრანის მეშვეობით. შემდეგ გახურებულ ნარევს ისევ ათავსებენ ყინულზე , რათა შეინარჩუნოს პლაზმიდები ბაქტერიების შიგნით… თუ პლაზმიდის დნმ-ის ხსნარში ძალიან ბევრი მარილია, შეიძლება წარმოიშვას რკალი, რაც არღვევს ტრანსფორმაციას.
რატომ ათავსებთ მილებს ყინულზე?
როგორ ფიქრობთ, რატომ ვათავსებთ მილებს ყინულზე? იმისათვის, რომ დნმ ბაქტერიაში მივიღოთ, ჩვენ უნდა გავუტეხოთ ხვრელები მათში ქიმიური კალციუმის ქლორიდით (CaCl2). … ხვრელები გაჩნდა, რათა დნმ-მა შეაღწიოს, ბაქტერიები გაჟონავს. თუ მათ ყინულზე არ შევინახავთ, ისინი „სისხლამდე“მოკვდებიან.
რა როლი აქვს ყინულის ცივ კალციუმის ქლორიდს კომპეტენტური უჯრედების მომზადებაში?
კალციუმის ქლორიდის სითბოს შოკის ტრანსფორმაციის პროცესი ხელს უწყობს ბაქტერიულ უჯრედებს მიმდებარე გარემოდან დნმ-ის ათვისებაში. … ყინულივით ცივი CaCl2 ხსნარი აადვილებს დნმ-ის შეკავშირებას უჯრედის ზედაპირზე, რომელიც შემდეგ შედის უჯრედში სითბოს შოკის ხანმოკლე პერიოდის შემდეგ (3).
როგორ ინახავთ კომპეტენტურ უჯრედებს?
კომპეტენტური უჯრედები უნდა ინახებოდეს - 80°C-ზე. შენახვა -20°C-ზე გამოიწვევს ტრანსფორმაციის ეფექტურობის (TE) მნიშვნელოვან შემცირებას. NEB 5-alpha Competent E. coli-ზე (NEB C2987H) ტესტირებისას უჯრედებმა დაკარგეს TE-ის 94.5% -20°C-ზე შენახვის მხოლოდ 24 საათის შემდეგ.
